Jane K. A. Cook, Intervet UK., The Elms, Thicket Road, Houghton, Huntingdon, Cambs., PE 17 2BQ

Reproducido de las memorias del XVI  Congreso Latinoamericano  de avicultura, Lima Peru 1999.

INTRODUCCIÓN

La Bronquitis infecciosa (BI) continua siendo una enfermedad de mayor importancia para la industria avícola a nivel mundial  desde su descripción al inicio de los años 1930 (Anon, 1988; 1991).  El virus de la bronquitis infecciosa (BIV) pertenece al grupo coronavirus y causa una enfermedad respiratoria de sumo cuidado e importancia económica.  Afecta la producción y la calidad de los huevos  en gallinas ponedoras y gallinas reproductoras y se le reporta, frecuentemente,  como causa de nefritis.  La enfermedad producida por el virus ha sido descrita en detalle (Cavanagh y Naqi, 1997). 

Este artículo considera los métodos de diagnóstico disponibles y las formas de diferenciación entre los serotipos del virus.

DIAGNÓSTICO

El diagnóstico certero de la bronquitis infecciosa es difícil.  Existen dos razones de peso para esto.  Primero, la enfermedad respiratoria y el efecto sobre la producción y calidad de los huevos producida por el BIV son fácilmente confundidos con otras enfermedades causadas por otros patógenos aviares.  Segundo, debido a que el BIV puede rápidamente alterar su característica antigénica, ya sea por mutación o por recombinación, nuevas variedades antigénicas del virus continúan apareciendo, haciendo la identificación cada vez más difícil (Cavanagh et al., 1992).

Antes de intentar cualquier tipo de diagnóstico es necesario considerar las razones por las cuales se requiere un diagnóstico.  Se dispone de diferentes métodos para el diagnóstico y la información requerida, puede influenciar en la decisión sobre el método de elección.  

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DISPONIBLES

Signos clínicos

BIV causa una infección respiratoria moderada y pasajera, particularmente en aves jóvenes.  Como en el caso de otras infecciones respiratorias, como por ejemplo, la enfermedad de Newcastle, frecuentemente se complica con infecciones bacteriales secundarias, resultando  en alta morbilidad y variable mortalidad.  En gallinas ponedoras y reproductoras, generalmente las infecciones por BI resultan en una reducción en el número de huevos y un aumento en la incidencia de huevos de baja calidad.  No solamente se afecta la calidad de la cascara del huevo, sino que también la albúmina puede presentarse muy acuoso o baja en viscosidad.   Este efecto en la calidad de la albúmina es típico de una infección por B.I.; pero el efecto sobre el número de huevos y la calidad de la cascara del huevo pueden ser el resultado de un sin número de otras causas, ambas, infecciosas y ambientales. De esta manera, debido a los signos respiratorios observados en aves jóvenes y la aberrante producción de huevos vista en ponedoras y reproductoras, la enfermedad es fácilmente confundible con otras, el diagnóstico diferencial sobre la base de los síntomas clínicos es extremadamente  difícil y no es recomendable.

Aislamiento del virus

El éxito en el aislamiento de BIV en parvadas comerciales no se logra fácilmente.   Sin embargo, el uso de aves centinelas mejora las posibilidades de aislamiento (Gelb et al., 1989).  Para el aislamiento del virus, muestras de tejido deben tomarse inmediatamente después que se observan los primeros síntomas clínicos, cuando los títulos del virus se encuentren al máximo.  En los casos de infecciones respiratorias esto es usualmente posible, pero cuando investigamos una producción de huevos errática, estos efectos no podrán apreciarse hasta algún  tiempo después del inicio de la infección viral.  Isopos traquéales/nasales o tejidos son, probablemente, es el mejor material para comenzar en los casos de infecciones respiratorias.  Cuando se examinen casos de nefritis, tanto el tejido renal como el del tracto respiratorio permitirán aislar  el virus.  En el caso de desórdenes en la producción de huevos donde no exista la presencia de infección respiratoria, el tejido mas apropiado para el aislamiento del virus, es el proveniente del tracto intestinal, como son  las tonsilas cecales (Cook y Ellis, 1988), o riñones (Chong y Apostolov, 1982).  Independientemente del tipo de tejido escogido, lo importante es su traslado al laboratorio inmediatamente, en hielo o congelado rápidamente hasta que todo este listo para intentar el aislamiento. 

Es importante recordar que cualquier el aislamiento obtenido de un virus de BI, puede provenir del virus vacunal y es escasamente posible distinguir entre el aislamiento de un virus vacunal y el aislamiento de un virus de campo.  Es aconsejable por lo tanto considerar seriamente, si en realidad es necesario intentar el aislamiento del virus.  En el caso de estudios epidemiológicos y de investigación, o cuando se sospecha de un nuevo tipo de virus, el aislamiento puede ser requerido, pero frecuentemente, la detección del virus o confirmación serológica de la infección de BI puede ser suficiente y  adecuada.

El tratar de aislar el BIV en cultivo de tejidos no es una opción viable debido a que el virus requiere adaptarse al cultivo de tejidos antes que pueda ser detectado.  El sistema tradicional para aislar el virus de BI es a través del pasaje en huevos embrionados. Pero  En muchos laboratorios este método ha sido abandonado y reemplazado por el uso de cultivos de órganos de la traquea (TOCs),  cuya sensibilidad comparativa es más favorable que el método de los huevos embrionados (Cook et al., 1976), Estos son más económicos, pues se pueden obtener por lo menos 20 TOC de un solo embrión y los resultados están disponibles a los 3 días posteriores a la inoculación.   En el caso de los exámenes  en embrión de pollo, los resultados  no pueden completarse hasta despues de los siete días posteriores a la inoculación con el virus de BI.   Mas aun, la lectura de los TOCs es menos subjetiva que la lectura del examen de las  lesiones en los embriones.  Sin embargo, se ha sugerido (Clarke et al., 1972) que la lectura puede ser mas simple,  si el líquido alantoideo es centrifugado y el paquete de células es coloreado específicamente con un antisuero BIV especifico de  fluorescente marcado.  Independientemente del uso de cualquiera del sistema descrito, Es generalmente necesario efectuar varios pasajes ciegos antes de que la muestra pueda ser considerada como negativa.  De acuerdo a lo descrito, resulta evidente  que el proceso de aislamiento del virus de la BI a partir del material de campo es un proceso difícil y  que consume mucho tiempo, sin que exista una garantía real de que el resultado final será el esperado.

Detección del virus

Existen un sin número de técnicas para lograr la detección del virus:

Microscopía.

El examen, a través del microscopio electrónico, de muestras de campo ya sea directamente o después de haber sido cultivadas en el laboratorio  ha sido exitosamente usado (Gough et al., 1988).

Anticuerpos monoclonales / inmunoquímica.

Se han desarrollado técnicas para detectar BIV directamente en muestras de tejidos provenientes de pollos infectados o en fluido alantoideo o en la membrana corioalantoidea, obtenidos de huevos embrionados  inoculados con material de campo.  Anticuerpos monoclonales que son ya sean específicos a un serotipo de BIV en particular o que  pueden detectar todos los BIV conocidos, han sido usados en métodos de inmunofluorescencia y métodos tales como ELISA capturado  (Naqi, 1990; Naqi et al., 1993; Karaca et al., 1992).  Estas pruebas tienen ventajas potenciales, pero su sensibilidad específicidaa precisa ser mejorada antes que puedan ser usados en forma rutinaria para el diagnóstico.

La reacción en cadena de polimerasa.

Técnicas que hacen uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) están siendo desarrolladas para el diagnóstico de BI por diferentes grupos, usando procesos diferentes.  EL uso de PCR junto con el análisis de restricción enzimática (Kwon et al., 1993; Jackwood et al., 1997), han permitido encontrar y producir perfiles para cada serotipo de virus de BI muestreado, de tal manera que nuevas cepas de virus de BI puedan ser comparadas con las existentes en estudios epidemiológicos.  Si bien es cierto que se requiere más trabajo para validar esta prueba, la técnica promete ser una alternativa rápida para el diagnóstico y diferenciación de los serotipos de BI (Keeler et al., 1998).  El hecho de que la técnica ha sido usada con éxito en BIV tratado con fenol (Jackwood et al., 1998), significa que materiales tratados puedan ser enviados en la actualidad de país a país sin contravenir las disposiciones legales existentes para la importación.  Esto ha permitido que aislados de diferentes países puedan ser comparados con la finalidad de obtener información epidemiológica de interés.

Un proceso diferente usando iniciadores (primers) que son  específicos para diferentes serotipos de BI o que detectan todos los BIV conocidos (Cavanagh et al., 1996; Adzhar et al., 1996), ha permitido un estudio epidemiológico sobre la infección de BI en parvadas comerciales.  Estos estudios preliminares ofrecen posibilidades interesantes en el trabajo a futuro.   Sin embargo, es importante recordar que la técnica PCR detecta ácido nucleico y no al virus vivo, de tal manera que el significado de un resultado positivo en términos de indicar si existe o no una infección activa en la parvada, es una de las preguntas que queda por ser  contestada.

Estos métodos de detección tienen la ventaja de ser rápidos y sensibles y que por lo tanto,  existe  la  posibilidad  de  que en el  futuro  se   usen más ampliamente.   De todas maneras,  se requiere  de   reactivos  que en la actualidad no  están   ampliamente   disponibles   para  los  laboratorios de diagnóstico rutinarios y que muchas de estas pruebas requieren de validación adicional.  La técnica PCR es ciertamente una herramienta poderosa, pero debido a que su uso parece ser simple y directo, existe el riesgo de usarla sin el cuidado adecuado y sin que esta haya sido debidamente validadá y estandarizadá. En el caso de BI, se precisa todavia demostrar que es más sensible que la prueba del aislamiento viral (Kherna & Jones, no-publicado).    Actualmente es utilizada solamente  como una herramienta de investigación, pero en el futuro encontrará su sitio valioso  en los laboratorios de diagnóstico.

Un área importante  de interés para el futuro es la posibilidad de que los virus vacunales y de campo puedan ser diferenciados por medio de PCR.   Esto sería de mucho valor para la técnica.  Sin embargo, su extremada sensibilidad significa que la contaminación cruzada sigue siendo una seria y bien conocida dificultad, indicando que la técnica sólo podría ser llevada a cabo en laboratorios dedicados o especializados.

Serología

Pruebas serológicas en las que la respuesta específica a un anticuerpo a la infección de BIV, son las mas usadas como método de diagnóstico.  Esta respuesta van a presentarse por un tiempo prolongado, así que pueden ser una respuesta a una infección temprana o a la vacunación.   Por lo expuesto, cuando se usan pruebas serológicas para el diagnóstico de BI es necesario el analizar muestras de suero pares, obtenidas tan pronto sea posible después de la aparición de los primeros  síntomas y luego varias semanas posteriores a las primeras muestras.   Estas muestras deben ser analizadas conjuntamente y usando el mismo método incluyendo los controles apropiados para la prueba.  Así, cualquier incremento del título de anticuerpos  entre los dos grupos de muestras puede ser considerado como una indicación de respuesta  de anticuerpos a una infección reciente o a una vacunación.  La experiencia nos indicará  los  niveles  normales  en  la  respuesta  a  las  vacunaciones  y  estas  respuestas en algunos casos podrán ser diferenciadas de aquellas correspondientes a retos de campo.  Es también importante considerar a las pruebas serológicas como pruebas de parvada en lugar de pruebas individuales y de esta manera asegurarse que el número de muestras es suficiente grande  como para ser representativa de la parvada.   

Tres clases de anticuerpos pueden producirse como respuesta a la inoculación del virus de BI - IgA, IgM e IgG.  IgM es el primero anticuerpo en aparecer luego de la infección con BI,  títulos pico se logran aproximadamente entre los 7 y 8 días de la infección.  Detección de IgM puede, entonces, considerarse como indicativo de una infección reciente y en la actualidad existen pruebas para medir este tipo de anticuerpo. (De Wit et al., 1998).  IgA normalmente es producido en secreciones locales como el fluido lacrimal o la saliva y es una importante primera línea de defensa contra el reto por BI.  Puede ser identificado (Cook et al., 1992), pero no se realiza en forma  de rutina.  IgG es el anticuerpo de  mayor presencia en el suero luego de una infección por BI, se encuentra presente desde los 7 días posteriores a la infección por BI y puede persistir por algún tiempo.  Este es el anticuerpo medido normalmente en las pruebas serológicas de rutina que se efectúan.

Pruebas serológicas.

Un número de pruebas se encuentran disponibles para detectar anticuerpos específicos  de BI y es importante tener conocimiento de lo que miden, y de sus ventajas y desventajas.

 Precipitación en agar gel (AGP).

Es una prueba muy insensible y  no se usa ampliamente.  Sin embargo, por su simpleza y bajo costo, puede ser de utilidad en los casos de parvadas, debido a que se pueden procesar un gran número de muestras en forma rápida. Las precipitinas sólo están presentes por un periodo de tiempo muy corto luego de la inoculación,  por lo que su detección indica una reciente exposición a BI (MacDonald et al., 1982).  Esta es la ventaja principal  de esta prueba.

ELISA.

Esta prueba es rápida de efectuar y muy sensible.  Es ampliamente utilizada para el diagnóstico de BI y existen en el mercado varios kits comerciales.  Es importante recordar que la prueba de ELISA detecta la respuesta específica del grupo BI y por lo tanto su uso para diferenciar entre serotipos de BI, es límitado.

Prueba de inhibición de la hemoaglutinación (HI).

 Esta prueba amplía su uso día a día.  Desafortunadamente, debido a que el virus de BI precisa ser tratado con una enzima antes de que aglutine eritrocitos de pollo, la preparación del antígeno es laboriosa, consume tiempo y su estandarización es de gran importancia (Alexander et al., 1983).  La prueba HI puede ser usada para la diferenciación entre serotipos de BI, siempre y cuando sea efectuada con gran cuidado.  Precisa incluirse un juego completo de sueros positivos y negativos como control en cada prueba y utilizarse el antígeno HI para cada serotipo de BI que se desee analizar (Brown & Bracewell, 1985; Cook et al., 1987).

Prueba de suero neutralización (SN).

Es indudablemente la mejor  prueba a usarse cuando sea necesario diferenciar entre serotipos de BI.  Sin embargo, es una prueba  costosa y requiere de tiempo (aún cuando se efectúe en TOC).  Por esta razón, es aconsejable considerar cuidadosamente sí en realidad es necesario conocer el serotipo de BI involucrado en un brote de la enfermedad.  Pueden existir ocasiones cuando este tipo de información es requerida, pero en la mayoría de casos es suficiente con confirmar que el virus de la BI es el causante  del problema.   Ahora sabemos que la protección contra un reto de BI es más amplio que los resultados que sugieren los resultados de la serotipificación in vitro.  Debido a que actualmente existen vacunas que brindan protección contra varios serotipos diferentes de BI, las estrategias de protección pueden desarrollarse ahora sin tener conocimiento del serotipo de BI, en particular, involucrado en cada brote de la enfermedad (Cook et al., 1998).  Entonces, por consideraciones prácticas, es más importante obtener información sobre la eficacia de las vacunas disponibles frente al aislado particular de BI, que sobre la determinación del serotipo.

CONCLUSIONES

El diagnóstico de las infecciones de BI es difícil, principalmente debido a las dificultades que presenta su diferenciación con otras enfermedades aviares que causan síntomas clínicos similares y, por tanto, debe cuidarse el valor que se le da a la interpretación de los resultados obtenidos. Antes de intentar un diagnóstico de BI, es recomendable considerar el uso que se va a dar a la información, de tal forma que el mejor método disponible sea el escogido a fin de obtener el máximo de información con relación al esfuerzo invertido.  En general, los métodos disponibles no son ideales y esperamos que mejoras técnicas se lograrán a través de los esfuerzos de investigación que se están realizando en esta área, por varios grupos en el ámbito mundial. Métodos  inmunoquímicos o métodos basados en el uso de PCR pueden encontrar un lugar futuro en los laboratorios de diagnóstico,  sin embargo, pareciera que a pesar del desarrollo alcanzado, estas técnicas no van a permitir ubicar las respuestas a todos nuestros problemas de diagnóstico.

REFERENCIAS

1.      Adzhar, A., Shaw, K., Britton, P. & Cavanagh, D. (1996). Universal oligonucleotides for the detection of infectious bronchitis virus by the polymerase chain reaction. Avian Pathology, 25: 817- 836.

2.     Alexander, D.J., Allan, W.H., Biggs, P.M., Bracewell, C.D., Darbyshire, J.H., Dawson, P.S., Harris, A.H., Jordan, F.T.W., MacPherson, I., McFerran, J.B., Randall, C.J., Stuart, J.C., Swarbrick, O. & Wilding, G.P. (1983).  A standard technique for haemagglutination inhibition tests for antibodies to avian infectious bronchitis virus. Veterinary Record, 113: 64.

3.     Anon. (1988). Proceedings of the First International Symposium on Infectious bronchitis (E.F.Kaleta & U.Heffels-Redmann,eds.),  Rauischholzhausen,Germany.

4.     Anon.(1991). Proceedings of the Second International Symposium on Infectious bronchitis (E.F. Kaleta & U.Heffels-Redmann,eds.), Rauischholzhausen,Germany.

5.      Brown, A.J. & Bracewell, C.D. (1985). Application of the haemagglutination inhibition test to typing of infectious bronchitis virus. Veterinary Record, 116: 47- 48.

6.      Cavanagh, D., Davis, P.J. & Cook, J.K.A. (1992). Infectious bronchitis virus: evidence for recombination within the Massachusetts serotype.  Avian Pathology, 21: 401- 408.

7.      Cavanagh, D., Mawditt, K., Shaw, K., Britton, P. & Naylor, C. (1996). Towards the routine application of nucleic acid technology for avian disease diagnosis. Acta Veterinaria Hungarica, 45:281- 298.

8.     Cavanagh, D. & Naqi, S.A. (1997).  Infectious bronchitis. In Calnek, B.W., Barnes, H.J., Beard, C.W., McDougald, L.R. & Saif, Y.M. (eds) Diseases of Poultry, 10th edition. pp 511- 526. Ames, Iowa State University Press.

9.      Chong, K.T. & Apostolov, K. (1982). The pathogenesis of nephritis in chickens induced by infectious bronchitis virus. Journal of Comparative Pathology, 92: 199-211.

10.   Clarke, J.K., McFerran, J.B. & Gay, F.W. (1972). Use of allantoic cells for the detection of avian infectious bronchitis virus.  Archiv fur die gesamte Virusforschung, 36: 62-70.

11.   Cook, J.K.A., Darbyshire, J.H. & Peters, R.W. (1976). The use of chicken tracheal organ cultures for the isolation and assay of avian infectious bronchitis virus.  Archives of Virology, 50: 109-118.

12.   Cook, J.K.A., Brown, A.J. & Bracewell, C.D. (1987). Comparison of the haemagglutination inhibition test and the serum neutralisation test in tracheal organ cultures for typing infectious bronchitis virus strains. Avian Pathology, 16: 505- 511.

13.   Cook, J.K.A. & Ellis, M.M. (1988). Long term studies on serotyping European IBV strains. In: Proceedings of the First International Symposium on Infectious bronchitis (E.F.Kaleta & U.Heffels-Redmann,eds.),  Rauischholzhausen,Germany pp 224-228.

14.   Cook, J.K.A., Otsuki, K., Martins, N.R. da Silva, Ellis, M.M. & Huggins, M.B. (1992). The secretory antibody response of inbred lines of chicken to avian infectious bronchitis virus infection. Avian Pathology, 21: 681- 692.

15.   Cook, J.K.A., Orbell, S.J. & Malo, A. (1998). Protection provided by live-attenuated infectious bronchitis vaccines against challenge with different IB serotypes. In: Proceedings of International Symposium on Infectious bronchitis and pneumovirus infections in poultry. Pp 366- 370. (E.F. Kaleta & U.Heffels-Redmann,eds.), Rauischholzhausen, Germany.

16.   De Wit, J.J., Mekkes, D.R., Koch, G. & Westenbrink, F. (1998). Detection of specific IgM antibodies to infectious bronchitis virus by an antibody-capture ELISA.  Avian Pathology, 27: 155- 160.

17.   Gelb, J., Rosenberger,  J.K., Fries, P.A., Cloud, S.S., Odor, E.M., Dohms, J.E. & Jaeger, J.S. (1989). Protection afforded by infectious bronchitis virus-vaccinated sentinel chickens raised in a commercial environment. Avian Diseases, 33: 764- 769.

18.   Gough, R.E., Alexander, D.J., Collins, M.S., Lister, S.A. & Cox, W.J. (1988). Routine virus isolation or detection in the diagnosis of diseases in birds. Avian Pathology, 17: 893- 907.

19.   Jackwood, M.W., Yousef, N. M. H. & Hilt, D.A. (1997). Further development and use of a molecular serotype identification test for infectious bronchitis virus. Avian Diseases, 41:105 -110.

20.   Jackwood, M.W., Callison, S.A.. & Hilt, D.J. (1998), S1 sequence analysis of International strains of IBV and comparison with strains in the US.  In: Proceedings of International Symposium on Infectious bronchitis and pneumovirus infections in poultry. Pp 257- 262. (E.F. Kaleta & U.Heffels-Redmann,eds.), Rauischholzhausen,Germany.

21.   Karaca, K., Naqi, S & Gelb, J. (1992). Production and characterization of monoclonal antibodies to three infectious bronchitis virus serotypes. Avian Diseases, 36: 903- 915.

 22.   Keeler, C.L., Reed, K.L., Nix, W.A. & Gelb, J. (1998). Serotype identification of avian infectious bronchitis virus by RT-PCR of the peplomer (S-1) gene. Avian Diseases, 42: 275- 284.

23.   Kwon, H.M., Jackwood, M.W. & Gelb, J. (1993). Differentiation of infectious bronchitis virus serotypes using polymerase chan reaction and restriction length polymorphism analysis. Avian Diseases, 37: 194- 202.

24.   MacDonald, J.W., Dagless, M.D., McMartin, D.A., Randall, C.J., Pattison, M., Early, J.L. & Aubrey, S. (1982). Field observations on serological responses to vaccine strains of infectious bronchitis virus administered by coarse spray and via the drinking water.  Avian Pathology, 11: 537- 546.

25.   Naqi, S. A. (1990).  A monoclonal antibody-based immunoperoxidase procedure for rapid detection of infectious bronchitis virus in infected tissues.  Avian Diseases, 34: 893- 898.

26.   Naqi, S.A., Karaca, K. & Bauman, B. (1993).  A monoclonal antibody-based antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay for identification of infectious bronchitis virus serotypes.  Avian Pathology, 22: 555- 564.